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羊痘病毒致宿主细胞病变研究进展

摘要: 羊痘病毒是一种在细胞质中进行复制的DNA病毒,可侵染上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、羔羊睾丸细胞和肾细胞等多种细胞并致细胞病变,形成胞浆包涵体。

    羊痘病毒是一种在细胞质中进行复制的DNA病毒,可侵染上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、羔羊睾丸细胞和肾细胞等多种细胞并致细胞病变,形成胞浆包涵体。目前,已知的羊痘病毒宿主细胞不少,因此,对羊痘病毒所致宿主细胞病变做一综述,对认识羊痘病毒对体内外宿主细胞的不同作用及影响有一定帮助。同时,结合近年来对羊痘病毒宿主细胞的进一步认识,讨论了研究相关体外试验的必要性及可能性。

    羊痘病毒属于痘病毒科脊髓动物痘病毒亚科中羊痘病毒属成员,包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒3个成员.可引起山羊痘、绵羊痘和牛结节性皮肤病。山羊痘和绵羊痘为急性接触性传染病,可引起发热、皮肤黏膜和肺脏发生痘疹,是所有动物痘病中最为严重的一种。CaPV在电镜下为卵圆形或砖形颗粒,大小约为.是为数不多的在细胞浆内进行DNA复制和蛋白质合成的有囊膜双链DNA病毒,由1个核、2个侧体和2层脂质外膜组成,属于较小的痘病毒粒子。目前,有关羊痘诊断方法、疫苗研制、免疫机制等方面国内外报道较多口。但有关CaPV致宿主细胞病变研究较少。基于此,根据国内外近年来对CaPV在易感动物体内所致宿主细胞病变的新进展,结合本实验室在GPV方面的前期研究工作,本文综述了CaPV在易感动物体内引起宿主细胞病变和体外培养时的致细胞病变作用,讨论了进行CaPV体外感染神经细胞深入研究的可行性,这亦或有助于发现痘病毒宿主细胞新类型,在原有基础上丰富对痘病毒致病机制的认识。羊痘病毒致宿主细胞病变研究进展

1羊痘病毒在易感动物体内的致宿主细胞

    通过气溶胶经呼吸道传播,感染口咽淋巴组织,通过侵入门户经淋巴道进入循环血液后可血源性扩散到皮肤、呼吸道和消化道的多种宿主细胞,病毒也可经皮肤或消化道黏膜直接感染,在接毒部位细胞内复制和释放的病毒则可直接进入血液而引起病毒血症。病毒可在易感动物体内侵染鳞状上皮细胞、支气管上皮细胞、肺上皮细胞、毛细血管内皮细胞等多种细胞,在感染细胞胞浆内复制形成无结构的病毒浆,通过细胞膜出芽获得囊膜后一个一个向外释放病毒粒子从而引起细胞病变。

1.1鳞状上皮细胞

    羊痘最特征性的病变是在皮肤及上消化道黏膜出现痘疹,组织学检查可见皮肤和瘤胃黏膜的痘疹病灶鳞状上皮组织明显增生,细胞呈空泡变性及凝固性坏死,并可见嗜酸性胞浆内包涵体。电镜下可见细胞明显水肿,胞浆稀疏;线粒体肿胀变圆,基质电子密度降低,嵴变短或断裂变成小泡,有的线粒体明显肿胀形成泡状物;内质网扩张,可见小管泡状增生;高尔基复合体扩张,甚至破裂解体;胞浆内有大量散在的多为卵圆形的成熟病毒颗粒,而包涵体内见有大量不成熟的和部分成熟的病毒颗粒积聚。证实了胞浆内包涵体是CaPV繁殖。

1.2肺上皮细胞

    约有1/3以上的羊痘病例发乍多发性肺病变,表现为大小不同的厌白色结节,组织学特征是增生性肺泡炎与细支气管炎。肺上皮细胞水肿,明显增乍呈立方状平矮柱状,而状似腺瘤样改变这种改变曾被认为足由扁平的肺上皮化生为立方上皮。许乐仁等和周碧君等通过透射电镜观察发现山羊痘肺病变巾的肺上皮细胞具有Ⅱ型肺泡细胞特征性的板层小体样结构.胞浆内有稀疏的病毒颗粒”,提示r GPV感染时出现的这种肺上皮腺瘤样改变并不是扁平的I型肺上皮细胞化生为立方,而是Ⅱ型肺卜|皮细胞的增生现象。这一发现被最近的T作所证实,其选取10只自然感染SPV的羔羊肺组织进行试验,探讨其肺表面活化蛋白、甲状腺转录因子1、增殖细胞核抗原的表达,透射电镜下观察到巨噬细胞和支气管细胞的胞质有呈哑铃状大量痘病毒粒子侵润.通过免疫组化试验显示,增殖细胞核抗原高效表达,提示有支气管上皮细胞增生,且在Ⅱ型肺上皮细胞中义存在有表面活化蛋白的高效表达,该研究结果显示,SPV能引起Ⅱ型肺上皮细胞和支气管上皮细胞的显著增生。

1.3支气管上皮细胞

    在光镜下,支气管黏膜冈上皮细胞增生而屁著增厚,黏膜下结缔组织水肿、充血、出血并有大量炎症细胞浸润试验研究也证实SPV在引起Ⅱ型肺上皮细胞显著增生的同时也伴有支气管上皮细胞的显著增生。

1.4 巨噬细胞

    研究发现,在痘疹周围组织常可见巨噬细胞大量出现并吞噬痘病毒颗粒。光镜下,皮肤痘疹病灶的真皮层及周围结缔组织水肿并有大量巨噬细胞浸润,巨噬细胞因吞噬痘病毒颗粒后变性而体积增大.形成形态不规则、空泡化、染色质边集的所谓“痘细胞,其胞浆中可见到嗜酸性包涵体引起水肿和坏死的血管炎常形成血栓和梗死,血管周围有大量炎症细胞侵润。痘细胞也可见于呼吸道或消化道的痘疹病灶周围组织中,有认为受CaPV侵犯的成纤维细胞也可成为痘细胞。电镜下,巨噬细胞的线粒体肿胀,内质网扩张,胞浆内可见数量不等的病毒颗粒,病毒颗粒也见于巨噬细胞的溶酶体内,有时町见细胞的裂解和细菌的并发感染试验推断SPV有可能通过对巨噬细胞的刺激作用而调节宿主免疫反应。病变组织中所发现的巨噬细胞侵润很好地解释了山羊痘感染引发的炎症反应是因为巨噬细胞发挥吞噬功能。

1.5毛细血管内皮细胞

    在光镜下,痘病变部周围组织,尤其是皮肤痘疹病灶周围结缔组织中有血管炎发生和血栓形成,因而导致真皮及其上的表皮发生梗死。血管周围有巨噬细胞和中性白细胞等炎症细胞浸润和“痘细胞”出现。在电镜下,毛细血管内皮细胞肿胀;内皮细胞的线粒体肿胀,内质网扩张,胞浆内可见少量病毒颗粒.偶见少量病毒颗粒存在于血管腔内,血管内皮细胞的损伤是山羊痘病变部血栓形成并导致痘疹病变部细胞变性和坏死的病理学基础,而血管内皮细胞释放病毒颗粒无疑加重了病毒血症及病毒血源性扩散的进程。

1.6雪旺细胞

    痘病毒侵犯有髓神经纤维是一个偶然但十分重要的发现。在山羊痘皮肤痘疹病灶透射电镜观察时发现成熟的病毒颗粒和被病毒感染的巨噬细胞出现在神经外膜和神经内膜之间,有髓神经纤维可见轴索变性呈空泡状,其内神经微丝和微管等细胞器结构模糊,髓鞘板层结构模糊,并可见节段性脱髓鞘现象,雪旺细胞肿胀,胞浆稀疏,线粒体肿胀。胞浆中有少量病毒颗粒,也可见成熟的病毒颗粒游离于雪旺细胞外(图6)。联系到临床上山羊痘病羊严的精神沉郁,反应迟钝.特别是虽然全身皮肤出现痘疹但病羊却没有表现出明显的痒痛感,推测很可能与痘病毒侵犯有髓神经纤维而影响到神经的感觉与传递功能有关,进一步的研究将有助于阐明外周神经系统被痘病毒侵犯在本病发生发展过程中的病理生物学意义。

2 羊痘病毒致体外宿主细胞病变研究

    为进一步认识CaPV对宿主细胞的CPE及研制羊痘疫苗的需要,已有不少细胞被用于CaPV的体外培养研究。CaPV可在绵羊、山羊和牛源的组织培养细胞上生长,而羔羊睾丸细胞和肾细胞最为敏感,也可用Vero等细胞系进行培养。通过细胞体外培养技术,不但可能满足理想的羊痘疫苗的研制需要,还可在细胞分子水平或超微水平上进行羊痘病毒对各相关细胞病变的体内外比较研究,能为羊痘发病学过程的阐明提供更有力的依据,进一步认识CaPV在宿主细胞中的复制表达过程、感染细胞分泌的细胞因子动态变化、细胞调控及凋亡等方面的影响等。

2.1羔羊睾丸细胞和肾细胞

    原代或传代羔羊睾丸细胞和肾细胞对CaPV最为敏感等报告羔羊睾丸细胞和肾细胞在CaPV感染后可出现相似的CPE。早期的一些研究也已证实CaPV接种羔羊睾丸细胞和肾细后最早可在感染后3 d~4 d出现少量CPE,之后4 d~6 d CPE迅速扩展到整个细胞层,观察到CPE持续时间可达14 dE22]。周建胜掣“1和李有文等[253将羊痘病毒弱毒接种于生长良好的原代单层睾丸细胞,结果显示,接毒后24 h,细胞出现病变,部分细胞逐渐脱落圆缩,出现了清晰的轮廓;至48 h时细胞已有70%发生病变,但细胞圆缩不完全;60 h时细胞已有95%发生病变,大部分圆缩,有的脱落形成空斑;72 h时细胞圆缩达到85%以上,细胞堆积呈葡萄串状,说明绵羊睾丸细胞出现了明显的CPE。史宗勇等将羊痘病毒接种正常生长的羔羊睾丸细胞,接毒24 h后观察到部分细胞开始脱落圆缩,培养液中悬浮细胞增多,到48 h后细胞进一步变圆,聚集成簇,细胞间质增宽,部分细胞融合和脱落。近年来,证实阿拉伯胶树和丁子香的叶片提取物能抑制GPV的细胞内复制而降低其CPE,这一研究将有助于缓解羊痘病毒侵染细胞的能力。

2.2 BHK一21细胞

    CaPV能引起传代细胞BHK-21出现CPE。何光志等E28]用GPV接种传代BHK一21单层细胞,72 h后显现CPE,感染初期细胞变圆、收缩、聚集成簇;此后病变细胞形成拉网状,网间显现空隙;这种局灶性细胞病变逐渐扩展、弥漫、融合,最后细胞成片脱落死亡,而山羊痘参考血清能够抑制这种CPE。应用HE染色、凋亡试剂盒检测、流式细胞仪和

DNA Ladder检测证实GPV能够诱导BHK一21细胞发生凋亡,发现该细胞经HE染色后可见其发生皱缩,细胞形状不规则,染色质边集、呈环状、团块或新月形状,细胞质呈现明显的颗粒状浓缩样变,细胞严重变形,呈“星芒”状、“出泡”等CPE。但鞠厚斌等[303报道当BHK一21细胞传10代以上,就会出现部分细胞毒丧失了感染性问题。

2.3 Vero细胞

    通过倒置显微镜对接种GPV的传代Vero细胞进行观察。结果显示,在GPV感染36 h开始有细胞变圆,细胞间出现拉丝,开始集聚成葡萄状,48 h细胞开始脱落,拉丝状更加严重,但细胞凋亡发生比率不高,在此之后细胞凋亡数与细胞死亡数均随着感染时间的延长不断的增加,3 d~7 d感染细胞显现圆缩、聚集成簇等CPE。周碧君等口朝证实组织病料样本对Vero-E6细胞的适应性优于BHK-21细胞,可用于临床组织样本中GPV的初次分离,比用原代细胞分离省时省力。程振涛[2钉以GPV荧光抗体对感染细胞飞片染色,在细胞浆中检测到特异性黄绿色荧光。将Vero细胞培物经超薄切片后在透射电子显微镜下观察到细胞胞浆中含有大量不同成熟时期的GPV颗粒.说明GPV能引起传代Vero细胞出现CPE及细胞凋亡。

2.4其他细胞

    牛睾丸细胞培养山羊痘弱毒也可被用于疫苗研制试验[3“。Dubey S C等[圳曾将GPV培养在胚山羊单层肺细胞上。Davies F G等[35]观察了肯尼亚GPV和SPV对牛胎肌细胞培养物的致病性和免疫原性变化,发现传代15到20代时痘病毒致病性丧失,50代培养物能使动物血清中出现中和抗体,可保护皮内试验的攻击,而18代时即可成功地用于羊痘的现场控制。

2.5鸡胚绒毛尿囊膜

    CaPV也可在鸡胚绒毛尿囊膜上生长。周碧君等将GPV接种于10日龄鸡胚绒毛尿囊膜,结果显示,感染鸡胚可见胚体充血、出血,绒毛尿囊膜增厚,在接种部位出现明显的痘斑。透射电镜观察发现鸡胚上皮细胞明显水肿,胞浆稀疏;线粒体肿胀变成圆形,基质电子密度降低,嵴变短或断裂变成小泡,有的线粒体明显肿胀形成泡状物,甚至退变的膜性结构形成皱纹纸样结构或髓鞘样结构;内质网扩张,可见小管泡状增生;高尔基复合体的扁平囊、大泡及小泡扩张,甚至破裂解体;内质网和高尔基复合体中可见不成熟的病毒颗粒,而胞浆内散在成熟的病毒颗粒。许乐仁等发现在GPV感染的鸡胚上皮细胞内不成熟的病毒颗粒从内质网和高尔基复合体出芽直接突入胞浆而形成有囊膜的成熟病毒颗粒的现象,因此推理,虽然大多数病毒颗粒是通过胞吐或从细胞表面微绒毛释放而获得囊膜,但不排除病毒颗粒在胞浆内已经获得囊膜,当细胞裂解时可与无囊膜的病毒颗粒一起释放的可能性。

羊痘病毒致宿主细胞病变研究进展

3结语

    人类对CaPV的认识已经有100多年的历史,对CaPV感染易感动物的发病机理及其病理变化也有比较全面深入的研究,而在一些体外细胞培养物中CaPV的研究对于羊痘疫苗的研制、病毒的生物学特性及其致病机理的认识等提供了良好的模型。近年来,CaPV在易感动物体内宿主细胞致病变作用认识的不断深入,利用某些体外细胞培养物进行CaPV生物学特性的研究仍然是必要的。山羊痘肺病变中证实了羊痘病毒感染时出现的肺腺瘤样变是Ⅱ型肺泡细胞的增生现象,而并非是扁平的I型肺上皮化为立方上皮,这是不同于以往认识的一个新发现。Ⅱ型肺上皮细胞不但具有分泌肺泡表面活性物质的功能,而且具有潜在的增生与修复能力,而I型肺上皮细胞几乎没有这种分裂再生能力,通过对CaPV体外感染原代或传代Ⅱ型肺上皮细胞的深入研究,有助于进一步阐明Ⅱ型肺泡细胞的功能及在羊痘发病学上的意义。山羊皮肤痘疹病变部位出现痘病毒侵犯有髓神经纤维是一个十分重要的发现[8],使雪旺细胞成为最新被认识的CaPV宿主细胞,GPV侵犯外周神经现象的发现也有助于对羊痘的发病学进行新的认识。雪旺细胞是周围神经系统中特有的神经胶质细胞,也是周围神经的主要结构和功能细胞,它形成的髓鞘能保护轴突并使神经冲动在神经元上快速传递,而外周神经的脱髓鞘现象必然会影响到神经冲动的的感受与传递功能,这可能是山羊痘病羊虽然全身都出现痘疹,但临床上却表现为迟钝、沉郁、痛觉减弱甚至痛感缺失的原因。因此,研究体外CaPV感染雪旺细胞的CPE具有重要的病理生物学意义,不仅能进一步的阐明痘病毒的致病机理,甚至可能有助于进一步地认识在人类和多种动物痘病毒感染的发病机理中外周神经病理学变化的意义。目前,诸如Ⅱ型肺上皮细胞及雪旺细胞等细胞的体外培养技术已经日趋成熟,完全有可能获得羊源的或其他动物源的原代或传代Ⅱ型肺上皮细胞和雪旺式细胞用于CaPV的感染和CPE的深入研究,以丰富人类对痘病毒所致疾病的认识。

养殖技术王老师
作者/编辑: 养殖技术王老师

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