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山西舍饲羊群羊痘病毒的分离和实验室诊断

摘要: 为了分离舍饲羊群羊痘病毒并对其进行诊断研究.对山西舍饲羊群疑似羊痘发病羊的口唇痘状痴皮组织提取物进行细胞培养以扩增病毒,对病变细胞用苏木精一伊红染色法观察.然后进行动物回归实验和酶联免疫吸附测定。

    为了分离舍饲羊群羊痘病毒并对其进行诊断研究.对山西舍饲羊群疑似羊痘发病羊的口唇痘状痴皮组织提取物进行细胞培养以扩增病毒,对病变细胞用苏木精一伊红染色法观察.然后进行动物回归实验和酶联免疫吸附测定。结果表明:扩增的病毒经连续培养3代后出现规律性细胞病变;用常规HE染色可见细胞中出现由于病毒感巢产生的包涵体;动物回归实验表明已分离的病毒可导致动物发生痘性病变:用ELISA检测出现显色反应.表明样品中存在与酶标抗体发生反应的病毒抗原,样品病毒浓度为6.835实验成功诊断并分离出山西舍饲羊群羊痘.为后续研究提供了理论基础.

山西舍饲羊群羊痘病毒的分离和实验室诊断

    羊痘是由山羊痘病毒属的痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,包括绵羊痘和山羊痘。主要表现为发热、无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹.羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种,有较高的病死率,能造成巨大的经济损失,严重影响国际贸易和养羊业的发展.与我国接壤的周边国家,如印度、孟加拉、尼泊尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病流行[2].被世界卫生组织列为需上报的动物传染病,我国将其列为一类动物疾病.本病在公共卫生方面也有重要意义,中国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道.近几年来,该病又在我国各地频繁暴发,且越来越严重.随着国家对生态环境的重视,退耕还林和牧区变放养为圈养政策的实施,圈养模式下舍饲羊群羊痘的发生、感染又发生了新的变化,给养羊业造成了极大的危害.本研究通过病原分离、细胞培养、显微形态观察、动物攻毒实验和酶联免疫吸附测定检测,对黄土高原地区山西北部圈养羊群羊痘进行实验室诊断研究.旨在为后续防治研究提供科学依据.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 病料来源病料按无菌操作方法采自黄土高原山西省北部右玉县圈养羊群中疑似羊痘发病羊的口唇痘状痂皮组织.

1.1.2 实验材料初生羔羊睾丸:按无菌操作方法,摘取1~3月龄健康、雄性未免疫羔羊睾丸备用,山羊痘检测为阴性.无山羊痘抗体的健康敏感羔羊购于本地农户.

1.1.3主要仪器设备超净工作台,倒置显微镜.高速冷冻离心机,电子天平、C02细胞培养箱,立式压力蒸汽灭菌器.酶标仪等.

1.1.4 主要试刺与药品细胞培养用的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)

按常规方法配制,高温灭菌。4℃保存备用.小牛血清购自北京燕生政博生物科技有限责任公

司.胰酶购自上海浙沛生物科技有限公司.杜尔伯科改良伊格尔培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司.ELISA试剂盒购自上海锐聪股份有限公司.

1.2实验方法

1.2.1 山羊痘病毒分离及细胞病变观察病料处理:无菌取疑似山羊痘病羊口唇痘状痂皮组织,加1 000 IU.mL_1双抗pH值7.2的PBS溶液浸泡30 min,然后用PBS液清洗2次,用无菌剪刀剪碎,研磨充分后按体积比1 t5的比例加PBS溶液制成悬液,l 500 r.rain叫离心10 min,取上清液备用.睾丸细胞培养:无菌摘取睾丸,清洗、去除附睾,剥弃鞘膜、白膜,将睾丸组织剪成1~2 mm组织块,加入0.4%胰酶溶液37℃消化,当睾组织呈现膨松状态时。加2 mL小牛血清终止反应;加适量生长液(DMEM4-l%双抗+8%血清)清洗。去上清;再加适量生长液,摇晃成糊状,用吸管吹打分散细胞,80目铜网过滤,取滤液进行细胞计数.并用生长液配成约100万个.mL-1细胞的细胞悬液,每瓶10 mL分装(100 mL培养瓶)。5%c()2、37℃静置培养,至细胞长成单层.选生长旺盛、长势良好的原代细胞,用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸等比混合溶液1 mL。37℃消化,分装进行传代培养.病毒增殖培养:取长势良好的睾丸细胞.弃去瓶中生长液,加入2 mL DMEM清洗破碎细胞,加1 mL病料上清液轻摇、混匀,使其充分接触.37℃静置30 min吸附.每瓶补充9 mL维持液(3%犊牛血清+1%双抗+DMEM)、5%CO。,37℃静置继续培养.观察细胞病变并记录细胞病变特征.当75%的细胞出现病变后,及时冷冻,反复冻融3次,甩打培养瓶使细胞破碎释放病毒.弃传代正常细胞瓶中的生长液.加入上步收获的病毒液1 mL,37℃感应30rain,加入维持液9 mL、5%C02.37℃静置培养.反复3次,可见染毒细胞出现规律性病变;厦时收雌.冻存、备川

I.2.2感袭细胞包洒体脱察将浸酸清洗l‘净的载破片放^绑胞培养板小池巾.加A 1mL挈丸细胞悬渡进行培养至细胞K成单层.吸击细胞培养液加入病雌酿37℃静置30删n吸附,补充I mI.维持液进行培养1 80蛎的细胞出现腐变取出载玻片进行常规}IE染色染色完成后滴巾性树胶封固备川。

I.2.3动物回自实验取收状病毒液离心浓缩后进行绵羊回归立验选择无⋯羊痘抗体l~3爿龄链靡敏感绵手6 H,分为2组,每组各3只,其中第1组攻击强毒,每只1 m1.分2点胸腹部应内注射,攻毒后抛察1 4 d+每天测量直肠温度。记录发舾情况第2组等鲢注射医川生理盐水作为对照。

I.2.4 E1.ISA捡刚先随机取5条酶标板条进行晦标扳均一性考察。每采取3孔先测未择任十I处_哩扳条的A测定结L问变异系数为4 89蹦说叫所使1的脯标短质节鞍好.各孔之间性能卡H近.满足El,ISA试验要求反复冻融已收状的病毒3次,使病毒充分释放.51111 r min离心lo川n.取L清波0 5m1,加^等位的PBS缓冲破中备用将试剂盘提供的标准品振荡混匀拄照试剂盒说明书要求操怍,配制系列怀准-%,编号为1、2、3、4、5、6.对臆浓度为40.

2.1 山羊瘟病毒分离殛细胞病变观察将待检病料接种副羔羊睾丸细胞连续培养3代后山现明蛀的、规律性细胞搿变在倒置挂微镜F观察发现:羔羊睾丸细胞培养生K旺盛.72 h后80%以细胞贴壁.大部分细胞呈K梭形、=角jf;.细胞接毒2~4 d出脱细胞确韭.表现为36 h细胞州出现删|9:c.仆始咧缩,胞浆内颗粒增多,受去JE常形态(幽IB).48 h时大部分细胞聚集,有时成串璩状细胞开始破裂。

山西舍饲羊群羊痘病毒的分离和实验室诊断

3 讨论

    实验经过对疑似羊痘发病羊的口唇痘状痂皮组织进行病毒的分离与鉴定,用待检组织感染羔羊睾丸细胞.经连续培养3代后出现规律性细胞病变;病变睾丸细胞经常规HE染色后观察,可见部分病变细胞胞浆内含有圆形或卵圆形的、大小与正常细胞核接近的嗜酸性团块包涵体.包涵体属于蛋白质性质,主要由细胞内增殖的病毒颗粒形成,也可能是由于病毒感染细胞产生的一种反应生成物;用浓缩的细胞培养物对绵羊进行攻毒试验。可引起正常绵羊发生典型的羊痘病变;经ELISA检测,发现检测过程中出现显色反应,表明样品中存在与酶标抗体发生反应的病毒抗原.由此实验确诊了山西舍饲羊群羊痘.分离所得样品浓度为6.835IU.L。可用于后续研究使用.

    在病毒分离培养纯化过程中。羊睾丸原代细胞中至少包括生精细胞、支持细胞和间质细胞.随着不断地传代培养,优势细胞会逐渐生长起来,而其他生长速度较慢的,或对生长条件要求较高的细胞会被逐渐淘汰.对于小羔羊来说,应尽量选择使用间质细胞数量相对优势的1月龄羔羊睾丸[8-9].在细胞培养过程中要注意随时观察.特别是培养温度、溶液pH值和生长态势.特别要强调的是,睾丸所处的阴囊环境,生理状态下低于正常体温0.5℃左右.所以培养温度的选择特别关键.

    动物回归实验要注意病毒的用量、安全性、攻毒部位和方法.本实验所用病毒是经离心浓缩的培养物.未对病毒剂鼍和毒性进行系统研究。在实验过程中,要严格对实验动物进行隔离,关注动物福利并做好实验动物的最后处置,谨防实验对生活、生产的影响.攻毒部位应选择皮肤较薄、血供丰富的部位。攻毒方法有皮内注射、皮下注射和划痕等.本实验依据《兽医生物制品制造及检验规程》选择了皮内注射方法.EI。ISA检测方法是免疫学检验中最为常用的方法.具有较好的敏感性和较高的特异性.可用于疾病的临床诊断、疾病监查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等.在实际工作中EI。lSA法检测的全程质量控制很重要[10],优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证EI,ISA检测结果准确可靠的必要条件.实验过程中洗涤、加样是最主要的关键技术,操作时洗液放置时间过长易产生絮状物或混浊,造成堵孔或花板,导致干扰物残留,测量值失准.加样时应将所测样品充分混匀,避免人为因素造成的样品差异。


养殖技术王老师
作者/编辑: 养殖技术王老师

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